固体培养基的制备

固体培养基的制备：

1、称取

用精确度1/100的电子天平称取培养基所需药品。先根据配方计算出配置一定量培养基所需的各种成分药品的量，然后用天平准确称取。称量时用称量纸折叠成簸箕状盛放药品。称量纸的折叠方法。

2、溶化

培养基放入烧杯或瓷缸中，慢慢加入少量所需水，边加入边用玻璃棒搅拌。如果培养基中不含有琼脂，培养基不需要加热；如果含有琼脂，则需要用本生灯或电磁炉加热煮沸，完全溶解后，再补齐所需水，并搅拌均匀。如果配置的培养基量很大，可用不锈钢锅加热溶化，可先用温水加热并随时搅动，防止焦化，如有焦化现象，配制的培养基就不能使用，要重新配制。

配制培养基时不可用铜或铁的容器溶化，因铜或铁制容器可能会使培养基中的铜和铁的含量超标，影响实验（培养基中铜含量大于0.3mg/L，细菌不宜生长，铁含量超过0.14mg/L，妨碍细菌产毒素）。对容易发生反应，产生沉淀的药品，要分开溶解，最后加入培养基，如磷酸二氢钾和硫酸镁。

3、调pH

虽然培养基中含有缓冲物质成分，能使培养基的pH尽可能的保持在要求的范围内，但是配出的培养基若不符合要求，就要进行必要的调整。如果有已校准pH计，可用pH计。

如果没有，可用精密的pH试纸，再根据需要用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸（微调可用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L盐酸）调制所需的pH。

培养基的pH一般为7.4~7.6，也有酸性或碱性的。用氢氧化钠调整的需要高压灭菌的培养基，在调整pH时要调至高出所需0.1个~0.2个单位，因用氢氧化钠提哦啊正时，高压灭菌后，培养基大的pH要降低0.1~0.2。如培养基中含有碳酸钙成分，可不调pH。

4、过滤

配成的培养基，若无特殊要求，可省略此步。若有沉淀或浑浊，需要澄清的，液体培养基可用滤纸过滤。而固体培养基可用中间夹一薄层脱脂棉的双层纱布过滤。

如果过滤法还不能达到澄清的要求，则可用蛋清澄清法，即培养基加热冷却到50℃~60℃，装入三角瓶内（不超过容量的二分之一），按1000ml加入1个~2个鸡蛋的蛋清，用力摇晃3min~5min，高压蒸汽灭菌121℃、20min，取出趁热过滤即可。

5、分装

配制好的培养基根据不同的用途分装在三角瓶、试管等容器中，分装试管，如果试管量很大，可用自动分液器。

如果试管量少，可用漏斗分装。分装量不超过容器容积的三分之二。三角瓶以不超过容积的二分之一为宜；琼脂斜面以不超过试管长度的五分之一为宜，灭菌后，摆成的斜面为培养基的三分之一、底层为三分之二的量为宜；半固体琼脂分装量为试管长度的的三分之一。

用来接种或保菌的高层琼脂，分装量为试管长度的四分之一或三分之一，用来接种厌氧菌的要达到三分之二；琼脂平板，内径90mm的以13ml~15ml为宜，内径70mm的平板为8ml~10ml，制成的琼脂平板。

若表面水分较多，可将平板倒扣，放置在37℃培养箱内30min，干燥后再用。每批培养基另外分装一小玻璃瓶（约20ml）与该批培养基同时灭菌，为测定该批培养基最终pH。

6、灭菌

分装好的培养基应立即进行灭菌。

7、倒平板

灭菌溶化的培养基冷却到50℃左右后，倒入无菌干燥的培养皿中。培养基的温度不能过高，否则容易在培养皿的内盖上形成太多的冷凝水；温度太低，培养基又容易凝固成块，无法制成平板。

倒平板时，应在靠近酒精灯火焰进行，以免外界的杂菌落入平板内，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部，用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下，灼烧瓶口，用大拇指和食指把培养皿盖打开一条缝，至瓶口刚好伸入，倒入培养基，以铺满底为限，不超过培养皿高度的三分之一，迅速盖好盖，放在桌面上，轻轻地转动培养皿，使培养基分布均匀，冷凝后即可。

8、摆斜面

装在试管中的琼脂培养基，在灭菌完成后，趁热立即摆放在木棒（或玻璃棒）上，并完成适时地斜度，冷却后，琼脂凝固即成斜面。斜面长度不要超过试管的二分之一。

9、质量检查

培养基灭菌后应仔细检查一遍，发现有破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染，都要丢弃，不能再用。并测定其最终pH。

还需要进行无菌检查和效果检查。无菌检查是将灭菌后的培养基取1管（瓶）~2管（瓶），37℃恒温培养1d~2d，确定无杂菌生长；效果检查是用标准菌种接种在相关的培养基上检查菌的生长、形态及生化情况，与已知情况相符。两种情况都合格，配制的培养基方可使用。

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