不加dna，磷酸钙转染还会不会形成沉淀 转染后,核酸会整合到细胞的遗传物质中吗
非病毒载体，选择比较好的转染试剂，QIAGEN的superfect转染试剂，对原代细胞还可以。
采用电转。理论上任何细胞都可以通过电转，不足之处：需要电转仪器，缓冲液非常有讲究，不同细胞条件要自己摸索，细胞电转后，状态很不好。
DEAE-葡聚糖：这是早在1965年出现的转染方法。带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子，使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克，也可能是细胞内吞作用使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染，可重复性好，转染时要除掉血清。
磷酸钙共沉淀转染：最早在1973年开始采用。氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要，pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响，重复性不佳。此法较易得到稳定转染，但转染原代细胞比较困难。
电穿孔法：通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内的。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。此法每次转染需要更多的细胞和DNA，因为细胞的死亡率高。每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。
脂质体法：中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。脂质体法始于1987年，此法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对不同的细胞可能会干扰细胞的代谢。
非脂质体的脂质：新一代的脂质体技术，其与DNA结合形成胶束结构而非简单的双层膜结构，使DNA的传递更有效且细胞毒性明显降低。
活化的树状聚合物：该聚合物的高度树状分枝形成球形结构，借助每个球体无数活化的氨基末端凝聚在DNA上形成较为致密的结构，并吸附在细胞膜上，经内吞进入细胞。活化的氨基可以调节胞内溶酶体pH值，抑制降解活性，使DNA稳定存在。转染效率高，毒性低，可重复性好。血清的存在能显著提高转染效率。
病毒介导的感染：感染需要将目的基因克隆到特定的病毒体系中，经过包装细胞的包装得到改造后的病毒，再进行感染。优点是转染效率特别高，尤其是难以转染的原代细胞、活体细胞。
为什么磷酸钙转染并不稳定~
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。后者外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
转染技术的选择对转染结果影响也很大。磷酸钙转染技术是由Graham等于1973年首创，实验室中转染哺乳动物细胞最广泛使用的方法。其原理是借助形成一种DNA-磷酸钙沉淀物，使其粘附于细胞表面，通过细胞的内吞作用而使DNA被细胞捕获。
磷酸钙在良好的转染条件下，可以在293T等细胞的转染达到较高的转染效率。但磷酸钙转染有一个突出的问题，非常不稳定，尤其受PH值的影响非常大，在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个PH都可能导致磷酸钙转染的失败，经常即使最熟练的转染实验者也不能保证每次磷酸钙转染的成功，他们可能经常为莫名其妙的转染失败而沮丧。同时，他们还经常发现，往往小体积的转染比如6孔板以下的转染效果比较理想，可一换到大皿，经常转染效率下降很快。磷酸钙的先天缺陷往往是实验梗阻的主要原因。虽然磷酸钙成本很低，但细胞实验仅一块培养皿就十几块钱。虽然转染试剂的成本貌似节约了，但其他耗材和时间的成本却大大上升了！
EntransterTM-H受血清等环境的PH值等影响较小，即使采用质量一般的血清也可稳定地转染。EntransterTM-H在6孔板每孔的花费仅￥1.2元，比起一块培养皿就十几块钱的花费，已不是主要花费，这也正是一些实验室乐意用EntransterTM-H代替磷酸钙进行293T等细胞进行常规转染的主要原因。
转染(transfection)指真核细胞由于外源 DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程。
转染方法的分类
对外源基因转染方法的要求包括：转移效率高，不影响细胞正常生理活动，低毒性，容 易使用，重复性好，易获得稳定转化子. 根据转染的机制不同可划分为化学转染法和物理转染法两大类. 化学转染法 1.DEAE-葡聚糖法 DEAE 葡聚是
undefined
最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它 与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，用 DEAE-葡聚糖转染成功地用用于瞬时表达 的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。 2.磷酸钙法 磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法， 因为试剂易取得， 价格便宜而被广泛用于瞬时转染和 稳定转染的研究， 先将 DNA 和氯化钙混合， 然后加入到 PBS 中慢慢形成 DNA 磷酸钙沉淀， 最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入 DNA。磷酸钙 似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源 DNA 免受降解. 3.人工脂质体法 人工脂质体法采用阳离子脂质体， 具有较高的转染效率， 不但可以转染其他化学方法不 易转染的细胞系， 而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的 DNA， 以及 RNA, 和蛋白质。此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达，与以往不同的是脂质体 还可以介导 DNA 和 RNA 转入动物和人的体内用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体和 带负电荷的核酸结合后形成复合物， 当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质， 随 后 DNA 复合物被释放进入细胞核内，至于 DNA 是如何穿过核膜的，其机理目前还不十分 清楚。 物理方法 1.显微注射显微注射虽然费力，但是非常有效的将核酸导入细胞或细胞核的方法。 2.电穿孔 这种方法常用来制备转基因动物， 但却不适用于需要大量转染细胞的研究。 电穿孔法常 用来转染如植物园生智体这样的常规方法不容易转染的细胞。 电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上 打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系。 3.基因枪法 基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内， 这种方法适用于培养的细胞核 在体内的细胞。
基因转移的转移步骤
答：（4）将磷酸钙-DNA悬液转移至细胞单层上的培养液中，轻轻晃动使培养液混合。另一种方法是吸出培养液，直接将沉淀物加到细胞上，室温温育15分钟后加回培养液。然后在37℃、5%～7%CO2及一定湿度的培养箱中培养24小时。（5）转染细胞后可采用以下任一种方法处理：①吸出培养液和沉淀物，用PBS清洗细胞...
转染的时候怎么控制低拷贝
答：外源基因整合到染色体中的概率很小，单拷贝或低拷贝稳定整合的 DNA 会导致低水平的蛋白表达。稳定转染的转染效率只有瞬时转染的 1~10％，且适用于使用带有诱导型启动子的载体研究。常见的转染方法 常见的转染手段有物理方法、化学试剂和生物介导三大类。如电转染、显微注射、磷酸钙共沉淀、病毒转染等。不...
质粒转染的操作步骤有哪些?
答：生物转染: 针对难转染细胞，高效且生物安全，但可能涉及复杂条件。物理转染: 精确但设备要求高，需优化条件以减少对细胞的潜在损伤。具体方法大揭秘：阳离子脂质体转染: DNA/RNA/siRNA通过静电传递，LifeTechnologies™工具广泛适用，选对试剂至关重要。磷酸钙共沉淀: 利用钙离子促使DNA细胞内吞，检测...
质粒转染进细胞后,其DNA会不会整合进细胞DNA里面去?
答：有的会，有的不会。如高频重组菌株（Hfr）与F-菌株接合后，其F质粒中携带一部分该菌株的染色体DNA，这一部分DNA片段就有可能与F-菌株的DNA发生整合。
给脂肪细胞(3T3-L1)导入DNA(转染)用什么方法好?
答：脂质体、磷酸钙转3T3-L1效率非常低，逆转录病毒效率比较高。Amaxa有个电转kit效率也是很好的
将重组DNA导入细胞内有哪些方法?它们的原理是什么?
答：(2)将重组体DNA包装成噬菌体，使外源基因导入宿主细胞称转导，在适宜条件下使转化率提高。(3)将外源基因导入动物细胞常用方法有磷酸钙转染技术，电穿孔转染技术，脂质体载体法，DEAE-葡聚糖转染技术，显微注射法等。将外源基因导入植物细胞常用方法是用Ti质粒将外源基因导入植物的外植体，也可将植物细胞的...
如何生产高滴度的慢病毒
答：2.转染 高效率的转染也是保证高滴度的关键。在考虑转染条件时，不光要看转染 效率，还要看细胞毒性。事实上，状态好代数低的293T细胞都很容易转 染，因此，在慢病毒包装的转染实验中，我们应该更多地去关注细胞毒性 问题。正因如此，有不少方案推荐使用磷酸钙转染法。但磷酸钙转染法操 作繁琐，对 pH...
基因转染方法转染
答：二、基因运载系统将某一特定的靶基因传递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概括为两大类：非病毒方法和病毒方法（一）非病毒方法直接注射法磷酸钙共沉淀法脂质体染法分类受体介导的基因转移显微注射法电穿孔法微粒子轰击法DEAE-葡聚糖和polybrene聚阳离子法精子载体法为什么需要应用转染...
细胞转染目的,转染成功证明什么?有什么意义
答：细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。细胞转染技术有助于研究和控制真核细胞基因功能。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。随着基因与...
细胞转染目的,转染成功证明什么?有什么意义
答：细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。细胞转染技术有助于研究和控制真核细胞基因功能。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。随着基因与...
