酶切技术的酶切实验 酶切法原理

实验目的：
1．掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理。
2．掌握重组质粒DNA的酶切鉴定方法。
3．掌握琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。
基本原理
限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。
主要试剂
重组质粒DNA插入片段300bp
本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ，其识别顺序为：
5′----G↓AATTC----3′
3′----CTTAA↑G----5′
磷酸二脂键断裂产生5′粘性末端。
操作步骤
1.反应体系的建立：
⑴在一无菌1.5mlEppendorf管中加入：?
无菌双蒸水7μl?
10×酶切缓冲液2μl?
质粒DNA(100ng/μl)10μl?
EcoRⅠ(5U/μl)1μl?
总体积为20μl
⑵轻轻混匀，12000rpm离心5sec。
2.37℃水浴1h。
3.将Eppendorf管置65℃水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应。
4.12000rpm离心5sec，将管盖及管壁上的水离下。
酶切技术
5.取10μl消化产物，与2μl6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100V30～60min。
6结果观察。
操作注意事项：
1.吸样量一定要准确
2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶
3.要求在冰上操作，并充分混匀，
4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。
5.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败
。
限制性内切酶酶解中常见的问题和原因
1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。
2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。
3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力；②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它DNA。

DNA片段的制备 完全酶切部分酶切的方法区别~

完全酶切，是指使用的内切酶在目标片段上的切点全部切开，切出来的片段大小不会因为酶量增加，或酶切时间加长而导致片段大小发生改变（确保不发生星号活性的量和时间）。克隆构建载体时，就是使用的完全酶切。所有的切点都切了。
部分酶切是指，只对片段上一部分酶切位点产生切割。这种一般是在建库，或者需要酶切基因组后，获得一定大小范围内的片段而使用的酶切方法。这种酶切不要求获得某一大小的片段，而是要获得例如200-500bp的片段，在电泳上没有条带，而是smear。所以部分酶切需要严格控制酶的用量和时间，要尝试稀释后的酶液，切一定时间段内，哪一个条件可以获得目标范围的片段。
部分酶切的条件需要更多的摸索，而且重复性要求也会更高。

酶切法原理：
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。可分为三类：
Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，其修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5'- G↓AATTC-3'），有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称黏性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的黏性末端。

扩展资料：
限制性酶切分析法是指基因组或一段核酸用限制性内切酶消化产生的片段经电泳等方法分离形成独特的条带图谱，对DNA序列的特征进行的分析。
限制性酶是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用。
限制酶是基因工程中所用的重要切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶，并且已经商品化，在基因工程中广泛使用。
根据限制酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位无特异性的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割。
参考资料来源：百度百科-限制性酶切分析法

酶切技术的酶切实验
答：操作步骤1.反应体系的建立：⑴在一无菌1.5mlEppendorf管中加入：?无菌双蒸水7μl?10×酶切缓冲液2μl?质粒DNA(100ng/μl)10μl?EcoRⅠ(5U/μl)1μl?总体积为20μl⑵轻轻混匀，12000rpm离心5sec。2.37℃水浴1h。3.将Eppendorf管置65℃水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应。4.12000...

酶切的实验原理及步骤
答：染色完成后，荧光带的分布将揭示DNA片段的大小。别忘了拍照记录这一重要瞬间。观察与分析 - 仔细分析电泳照片，解读荧光带的位置，从而确定DNA片段的精确大小和可能的序列信息。实验过程中，每个步骤的精确执行至关重要，如控制DNA溶液的体积、酶的活性和浓度，以及紫外线处理和EB的安全使用。酶切实验不仅...

酶切的步骤
答：一、实验材料准备1. 材料：质粒DNA。2. 试剂：限制性内切酶、ddH2O。3 . 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅， 电泳仪，紫外透射观测仪。二、单酶切 1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：（1）质粒DNA：X μL（约1 μg）。（2）限制性内切酶：1 μL（约10 U）。（3）10×buffer：2 μL。

酶切的基本步骤
答：1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂(会使酶变性或产生星号货性)，不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA浓度较低，对Mg的浓度影响较小);同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用，特别...

为什么酶切实验要求加样迅速,要在冰上进行操作?
答：我觉得跟酶的活性有关．你希望反应只在你设定的条件下和时间范围内进行．但是一旦底物和酶混合，就有可能开始发应，这样子有两个可能问题，一是加样时，如果放在室温，而又不是酶的最佳反应温度，有可能出现非特异性反应，二是加样如果太慢，先加的样比后加的样总反应时间长太多，结果就产生误差．冰...

【实验视频】如何获得理想的酶切结果
答：酶切反应条件的优化</ - 使用合适的缓冲液，如含有MgCl2、NaCl等，同时注意添加酶活性辅助成分如DTT、BSA等。为了更好地理解酶切反应的微妙之处，我们特别推荐观看这一系列的实验视频【实验视频】带你认识酶切实验的全过程。在酶切实验中，要特别留意甘油浓度、离子浓度、温度、酶浓度和反应时间等易导致...

谁做过酶切质粒的实验啊,制感受态细胞然后转化呢?求详细过程及注意要点...
答：转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 转化中的受体细胞: 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株,常用 RM 符号表示。 转化方法:电击...

【实验视频】带你认识酶切实验
答：【i实验】探索酶切实验的奥秘</ 在i科研公众号的【i实验】栏目中，我们致力于以深入浅出的方式解析经典实验，为初学者提供实用的入门指南。今天，让我们聚焦在基础且至关重要的酶切技术上，它在分子克隆和基因工程中扮演着核心角色。限制性内切酶，简称限制酶，是细菌为了抵御噬菌体侵袭进化出的特殊...

本实验为什么选择双酶切?双酶切该注意什么?
答：本实验选择双酶切能保证酶的有效切割，双酶切该注意酶切顺序。在双酶切载体时2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。

限制性内切酶的酶切实验原理是什么?
答：II型限制性内切酶只需要二价镁离子的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA片段具有相同的末端结构，而且大多数的II型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，大部分II型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称之回文结构。生物帮上面有详细内容，加滤芯枪头（有菌） http://product.bio1000...