灰树花菌丝体的液态深层培养过程是怎样的？ 灰树花菌种的菌丝体应该怎样培养？

1.摇瓶培养液体菌种 这是液态深层生产灰树花菌丝体工艺中最基本的技术。摇瓶培养的液体菌种数量较少，可供发酵罐接种用，也可直接用于栽培生产，一般适用于扩接固体菌种（主要是栽培种），生产规模不大的菌种厂适宜采用。用摇瓶培养液体菌种，周期短，可连续多次扩大培养（不超过5次），对发菌速度、菌种质量一般无不良影响。

将培养液装入500毫升三角烧瓶内，每瓶装量为100毫升，加入10～15粒小玻璃珠或直径在0.8厘米以下的玻璃碎片，用棉塞和牛皮纸封口，121℃灭菌40分钟，取出冷却至28℃时接种。每瓶接入斜面母种数小块，使气生菌丝一面向上悬浮于液面，在24～26℃恒温下静止培养48小时。当气生菌丝延伸到培养液中时，置往复式摇床上进行振荡培养，振荡频率为80～100次/分，振幅（冲程）6～10厘米；如果用旋转式摇床，偏心距为4厘米，振荡频率为150～220转/分，因旋转速度过快，菌丝球一般较大，且菌丝球表面绒毛状菌丝少，不适于做菌种使用。因此，一般旋转式摇床的偏心距应作适当调整方可使用。摇床室温度控制在24～26℃，培养72～96小时。食用菌种类不同，摇床培养的技术参数也有区别，灰树花一般在25℃，200转/分钟，偏心距4厘米，摇瓶3～4天培养结束，培养液呈黄棕色，清澈透明，有许多菌丝小球，镜检菌丝球直径，要求在1～2毫米内。取样品离心过滤（2500转/分，15分钟），105℃烘干至恒重，称菌丝体干重，达10克/升即可。这样的菌种可再扩接于三角瓶内，每瓶接种菌液10毫升，继续扩大进行摇瓶培养，因菌丝球正处于旺盛生长状态，分散度好，能缩短摇瓶培养时间，快者2天即可终止培养。如果培养液混浊，大多是细菌污染的结果。培养液经显微镜检查合格后，方可用于生产。摇瓶培养的液体菌种，在4℃冰箱中保存20～30天，在15～20℃室温中保存5～7天，对接种成功率、产量均无不良影响。

在生产实践中，也可因陋就简利用大号玻璃瓶制备液态菌种，但要有效果较好的空气过滤装置。

2.菌丝体的三级扩大培养 一级种子罐定容35升，摇瓶种子通过装有阀门的接种管接入，按5%～7%的比例接入摇瓶种子1.5～2升，按发酵工艺培养成熟；一级种子再接入二级种子罐，定容350升，按10%接入一级种子35升，培养成熟。无论哪一级菌种罐，在接种前须先将罐体空罐消毒（135～140℃）1小时，再注入培养液实消。程序是先预热夹层至90℃，10分钟后，放蒸气进入内层升至115℃左右饱压恒温8分钟，不宜过久，以免破坏养分。然后向夹层注灌冷水降温，降至26℃即可接种。接种时，要注意开排气口，关进气口，降压至0.05兆帕。同时抽样镜检并用肉汤培养基检查培养液灭菌情况。0时，取样检查杂菌、0.D值（光密度）、初糖；12、24、36、48小时，各取样检查一次0.D值、残糖、pH。正常培养48小时后，pH降至5.0，0.D值净长0.5左右，糖耗一个单位左右，即可转接容积较大的第三级培养罐。

第三级培养罐容积10吨，一般定容7500升，培养液与消泡剂（聚环氧丙烷甘油醚）同时加入，消泡剂加入量占培养液的0.03%为2.5升。按10%接种量（2个二级种子罐接1个三级罐）接入菌种。先空消罐体（140℃）1小时，再实消（115～118℃）50～60分钟，然后降至25℃接种。前期培养温度25～26℃，后期26～27℃。pH控制在5.5左右，降低时则流加尿素，加量一般为培养液的0.2%。发酵前期通风量1∶05（体积/体积），中期温度上升可加大通风量至1∶1，并防止pH下降过快。接种后，叶轮转速180转/分，培养72小时后，中间每隔12小时取样测糖、氮、pH、杂菌。中途补料可增加菌丝生长速度，缩短发酵时间，增加菌体浓度。补料可分次在20小时、40小时、60小时补入，补入料量视具体情况而定。

注意控制培养时间，过早放罐菌丝体产量低，太迟则菌体老化自溶，三级罐一般培养3～4天即可。放罐标准：pH下降至5，残糖2.5左右，氨态氮不超过30毫克/毫升，菌球浓度达到1000～1500个/毫升，或经3000转/分离心10分钟，每100毫升菌泥湿重在20～25克。

液体菌种发酵要根据菌类生长要求选择不同工艺条件，灰树花一般控温25℃，罐压0.05兆帕，通气量（液体∶气体）1∶0.3～0.5，搅拌200转/分。

检查发酵液质量项目包括：纯度检查，镜检或平板培养无细菌、霉菌检出；活力检查，镜检菌球边缘菌丝分枝细密，用结晶紫染色时着色深，菌丝细胞原生质尚未出现凝集现象和空泡，培养液静止5分钟，菌泥不下沉；80%菌球直径小于1毫米。

培养液经板框压滤或连续离心分离得菌丝体，经烘干可以直接食用或作饮料、食品添加剂；也可提取灰树花胞内多糖，培养液浓缩可得胞外多糖，均可作为制备药物的原料。

含大量菌丝的培养液可代替母种用于原种生产，也可代替原种用于栽培种生产。用液体菌种扩大的菌种，发菌快，活力强，用于栽培定植快、污染率低。在大规模栽培中，菌丝体液可注接已灭过菌的栽培袋，一个5吨发酵罐，3天内便可生产3.5吨液体菌种，按5%的接种量计算，500克干料的栽培袋注入液体菌种25毫升，3.5吨液体菌种可接种70吨培养料，约14万个栽培袋。

灰树花液体发酵培养的步骤是怎样的？~

1.基础培养基
（1）斜面培养基（综合马铃薯—葡萄糖—琼脂培养基）马铃薯20%，葡萄糖2%，麸皮5%，蛋白胨0.4%，KH2PO4 0.2%，MgSO47H2O 0.1%，琼脂2%。
（2）培养液A.去琼脂综合PDA培养液；B.葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，KH2PO4 0.2%，MgSO47H2O 0.1%，维生素B130毫克/升。
2.研究方法
（1）菌丝干重的测定 发酵液经双层纱布过滤后得菌丝体，用水冲洗干净，置60℃烘箱中，烘至恒重，称量。
（2）液体种的制备 将培养15天的斜面菌丝接种于培养液中，25℃，150转/分钟，摇床振荡培养7天，无菌过滤得菌丝体，用无菌水冲洗干净，加4倍体积生理盐水及少量玻璃珠稀释、打碎菌球，摇匀，作为液体种子。
（3）碳源的筛选 将B液中的碳源分别换成2%的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、果糖、乳糖等23种碳素营养，以无碳源的B液为对照，在250毫升三角瓶中装入50毫升培养液，灭菌后接入5毫升液体种子，25℃，150转/分钟摇床振荡培养4天后测菌丝干重。
（4）氮源的筛选 将B培养液中的氮源分别换成氮素含量为0.06%黄豆粉、豆饼粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏等15种氮源，每种氮源3次重复，以无氮源的B液为对照，培养方法、条件、测菌丝干重。
（5）最适C/N比筛选 保持B液中的碳源浓度不变，去蛋白胨，按C/N比分别以3∶1、6∶1、9∶1、12∶1、15∶1、18∶1、21∶1、24∶1、27∶1、30∶1、35∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1添加硫酸铵。
（6）最适C/N下不同碳源浓度筛选 以最适C/N=21∶1为基准，按碳源（葡萄糖）浓度0.4%、氮源浓度0.02%递增，培养观察菌丝生长情况。
3.结果与分析
（1）灰树花对碳素的利用 灰树花对碳源的利用相当广泛，对单糖、寡糖、多糖及糖醇均可利用（表4-5）。
表4-5 不同碳源对灰树花菌丝生长的影响（毫克/百毫升）

在单糖中，葡萄糖的利用最好，其次是甘露糖，而对半乳糖的利用最差；在寡糖中，灰树花对麦芽糖的利用最好，其次是乳糖，而对棉籽糖的利用最差。灰树花在葡萄糖中比在果糖中生长要好，说明醛糖比酮糖更容易被灰树花利用。这一结论也可从麦芽糖与蔗糖的结果差异上得到证明，麦芽糖为两葡萄糖单体联接成的双糖，蔗糖为葡萄糖与果糖组成的双糖，灰树花在麦芽糖作为碳源的培养基中菌丝生长量是在蔗糖上的2倍多。糖醇作为碳源效果不好，甘露醇与甘露糖相比，菌丝干重值低得多。该结果与肖光辉等在猴头菌中的碳源试验结果相吻合。以乳糖作为碳源时，灰树花生长良好，显示其对乳糖的利用能力很强，这一点与石勇民等对猴头菌的研究结果不一致。此外，灰树花对糖醇（甘露醇）的利用比相应的糖（甘露糖）要差得多，对乙醇几乎不利用。
在多糖中，玉米淀粉是灰树花最好的碳源，其次是麸皮、玉米粉，而对糊精、纤维素的利用最差。张伟心等（1999）对灰树花液体培养条件的研究也证明，在麸皮5%，玉米粉1%，麦芽糖2%的培养液中，生长的菌球小，密度大，生物量高。在中等通气量（500毫升三角瓶装液量100毫升以下，生物量最多），初始pH6，25℃，200转/分钟，振荡培养144小时即可结束发酵。
以麦芽糖、玉米粉及麸皮为碳源，灰树花生长最好，菌丝干重最大。麸皮与玉米粉是农产品，价格低廉，在生产上代替葡萄糖做为碳源，可以降低成本。
（2）灰树花对氮素的利用 不同氮源对灰树花菌丝生长的影响有明显的差异（表4-6）。
灰树花对有机氮的利用强于无机氮，有机氮中以来源于天然农副产品中的黄豆粉、豆饼粉和玉米粉为最好，其次是酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、干酪素等多组分复合氮源，而在尿素或谷氨酸等单一组分的氮源中菌丝生长量最小，与对照无甚差异。无机氮中，对铵态氮和硝态氮均可利用，但对铵态氮的利用比对硝态氮的利用要强，这与有关资料报道的其他灰树花对氮源利用的情况基本一致。
表4-6 氮源对灰树花菌丝体的影响（毫克/百毫升）

酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、干酪素等有机氮源富含各种氨基酸，这些氨基酸可直接被菌丝吸收利用，因而，使用这类多组分复合氮源时，灰树花菌丝生长快，生物量较高。当使用无机氮为氮源时，菌丝必须利用无机氮合成其需要的各种氨基酸，而某些氨基酸几乎或者完全不能生物合成，从而影响菌丝的生长。因此，包括灰树花在内的多数灰树花虽然能利用无机氮，但生长缓慢。值得一提的是，灰树花在黄豆粉、豆饼粉、玉米粉等天然植物氮源中生长最好，收率最高。原因一方面可能是这些氮源中含有丰富的蛋白质以及多种生长刺激因子；另一方面可能是由于灰树花菌丝分泌的蛋白酶较适合于这类植物蛋白。因此，完全可以采用豆饼粉、玉米粉等农副产品加工中的下脚料作为灰树花生长所需的主要氮源物质，其效果比添加蛋白胨、干酪素、酵母膏、牛肉膏等贵重氮源物质还要好，且这些再生资源的开发利用最经济。
（3）C/N对灰树花菌丝生长的影响 灰树花可在较大范围的碳氮比中生长，而在C/N 比为15∶1～60∶1的范围内菌丝生长较好，并在C/N为21∶1时达最大值。当C/N比超过60∶1时，菌丝生长量急剧减少。因此，在以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的液体培养中，灰树花菌丝生长的适宜C/N比为15～60∶1，最适C/N比为21∶1左右。当C/N比固定在21∶1，碳素含量在3.2%以下，氮素含量在0.15%以下时，随着碳氮源浓度的增加，菌丝生长量逐渐增加，并以碳素含量在3.2%～4.8%、氮素含量在0.15%～0.23%时，菌丝生长速度最快，生物量最大。这与文献报道的菇类营养生长阶段最适C/N=20～40∶1，适宜氮含量0.06%～0.20%基本一致。当碳源浓度大于4.8%、氮源浓度大于0.23%时，就会出现菌丝生长受抑制的现象，说明营养物质并非越多越好。
以上结果是碳氮源单因子对灰树花菌丝生长的影响，多因子的综合交互效应有待进一步研究。

①培养室使用之前，要彻底打扫消毒检查调温设备换气设备遮光物门窗等是否完好，否则要及时修善
②菌袋(瓶)的摆放要按菌号接种时间分开放置
③培养室内菌袋放置要适量，以利于检查翻袋通风散热等
④温度控制在18~25摄氏度，在刚接种的第一周保持18~20摄氏度，第二周从25摄氏度逐渐降至22摄氏度
⑤通气:培养室要根据菌丝体的数量确定每天的通气次数及通气时间，应做到室内空气新鲜
⑥室内空气相对湿度保持50%~70%
⑦室内保持黑暗或弱光
⑧在接种后的第57911天应逐瓶(袋)检查，发现污染的菌种瓶(袋)及时取出登记，并分析原因
⑨培养室若有酸味臭味霉味等异味，要及时查找原因予以处理
⑩防止鼠害与虫害
⑾菌丝发满瓶(袋)之后要及时移出冷藏或使用，并作好培养室的周转计划
⑿作好菌丝体的生长记录

灰树花菌丝体的液态深层培养过程是怎样的?
答：检查发酵液质量项目包括：纯度检查，镜检或平板培养无细菌、霉菌检出；活力检查，镜检菌球边缘菌丝分枝细密，用结晶紫染色时着色深，菌丝细胞原生质尚未出现凝集现象和空泡，培养液静止5分钟，菌泥不下沉；80%菌球直径小于1毫米。培养液经板框压滤或连续离心分离得菌丝体，经烘干可以直接食用或作饮料、食品添...

灰树花液体发酵培养的步骤是怎样的?
答：（1）菌丝干重的测定 发酵液经双层纱布过滤后得菌丝体，用水冲洗干净，置60℃烘箱中，烘至恒重，称量。（2）液体种的制备 将培养15天的斜面菌丝接种于培养液中，25℃，150转/分钟，摇床振荡培养7天，无菌过滤得菌丝体，用无菌水冲洗干净，加4倍体积生理盐水及少量玻璃珠稀释、打碎菌球，摇匀，作为液...

灰树花菌种的菌丝体应该怎样培养?
答：④温度控制在18~25摄氏度，在刚接种的第一周保持18~20摄氏度，第二周从25摄氏度逐渐降至22摄氏度 ⑤通气:培养室要根据菌丝体的数量确定每天的通气次数及通气时间，应做到室内空气新鲜 ⑥室内空气相对湿度保持50%~70 ⑦室内保持黑暗或弱光 ⑧在接种后的第57911天应逐瓶(袋)检查，发现污染的菌种瓶(...

如何对灰树花发酵菌株的诱变进行筛选?
答：程序是：以灰树花Gr9801为出发菌株，采用紫外线连续诱变、分离纯化等方法，以斜面生长速度和液体摇瓶发酵产多糖总量为监测指标，筛选出一株遗传上相对稳定、适应液体培养的灰树花菌株GrUV04，该菌株在综合PDA培养基上生长速度快，菌体丰满纯白。在培养液中发酵生长力强，菌丝生物量达1.97%，胞内外多糖...

菌丝体的培养需要哪些条件(详细一点哦!)谢谢!
答：用115摄氏度30分钟灭菌。在无菌条件下用母种的菌丝体或孢子接种，然后换上已灭菌的5～6层纱布扎瓶口。在24～26摄氏度环境下，以振幅为8～10厘米、频率为每分钟100～120次进行振荡培养5～7天，液体内长成浓密菌丝体即成。深层培养：要求有发酵罐和无菌空气供给系统设备。工作时先通入蒸汽，对罐内液体...

鸡枞菌种植技术 如何种植鸡枞菌
答：1、培养技术。鸡枞菌通过液体深层培养菌丝体，作为提供研制营养食品及饮料的原料，其蛋白质含量高于其他菇类，尤其是赖氨酸和亮氨酸含量很高，所以鸡枞菌的液体深层培养菌丝体生产引起重视。培养基配方适用的液体培养基配方：配方1：蛋白膝2%，蔗糖2%，硫酸镁1．5%，磷酸二氢钾0.3%，维生素B11毫克/100毫升...

我想问一下菌种是怎样培养的
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液体菌种在生产、贮藏、运输与利用等方面有何特点?
答：液体菌种是相对固体菌种而言的，是指生长在液体培养基中的菌种或菌丝体。液体菌种的制作工艺在工业上称为深层培养或深层发酵。与固体发酵过程一样，是将纯种微生物接种到含有适当营养成分的灭液体菌培养基内，在控制温度条件下进行培养，根据需要，供给或不供给氧气。食（药）用菌都是好氧型真菌，需要在...

如何种植鸡棕菌
答：(2)深层培养工艺斜面母种～一级摇瓶种子(250毫升三角瓶，装液体50毫升，25℃-28℃，120转/分，2-3天）～二级摇瓶种子（500毫升三角瓶，接种量5%.,.10%）～发酵瓶(26℃，110转/分，36小时）菌丝体收率可达湿重10克/升。(3)分离浓缩烘干液体发酵培养菌丝成熟放罐后，通过板框压滤机或离心机分离...

鸡枞菌怎样种植?
答：1 菌丝体的液体培养 ⑴液体深层培养的研究和菌丝体化学成分的分析 华西医学大学生物系（赵呈裕等，1988）曾对鸡枞菌采用不同培养基进行液体深层培养的研究，并对所培养的菌丝体进行成分的分析，其要点及结果如下：所用菌种系采自四川西昌，经组织分离并经提纯获得的菌株。所用的液体培养基配方为：蛋白胨...