建库测序中的若干问题（1）
文库结构可分为以下几个部分：插入片段，P5、P7接头，测序引物结合位点及index。
P5、P7接头位于文库两端，可以与flowcell上的寡核苷酸结合，在簇生成和测序过程中可作为引物或起到固定模板链的作用。
Index是不同样本的区分依据，当同一条lane中混入多个样本测序时，即可根据index区分来自不同样本的reads。根据建库时使用接头结构不同，又分为单index文库和双index文库。随着测序通量的不断增加，每条lane可以容纳的样本量也越来越多，双index可以变化出更多种组合，且能够降低标签串扰的比例，因此一些对灵敏度要求较高的检测通常会构建双index文库[1]。
图中黄色和蓝色的部分是测序引物结合位点：index5在NovaSeq 6000和HiSeq X平台的测序方向是不同的。完成Read1、index7测序之后，NovaSeq 6000平台会继续以这条链为模板进行index5的测序，测序引物是flowcell上的P5接头，因此index5的测序方向和Read1、index7是一致的。而HiSeq X平台的index5、Read2测序则是在末端翻转后进行的，因此index5的测序方向与Read2一致，而与Read1、index7相反， 同样的index5在HiSeq X和NovaSeq 6000平台测得的序列是反向互补的，因此在填 写文库信息的时候一定要注意测序平台和序列的对应关系。
Illumina 测序仪在收集信号时，并不是拍摄一张彩色照片一次完成的，而是分 A、C、G、T 4 个波长，分别拍摄 4 张单色照片，然后通过软件处理把这 4 张图叠加成一张。这是一种权宜之计，目的是减少图片文件的大小，从而降低对于数据存贮空间的要求。但也有缺点，一旦某一张或几张照片的信号强度不够，或者没有信号，则图片的叠加就不能准确完成。 碱基不平衡文库 （即A、G、C、T 四种碱基的含量远远偏离 25%）在测序时会导致某些图片（波长）没有信号或者信号很弱，在碱基识别时准确性降低。常见的碱基不平衡文库有BS甲基化文库、单细胞转录组文库、PCR产物文库等，为了减少碱基不平衡对测序结果的影响，通常会混入一定比例的phix文库。
Phix 文库是校准文库 ，是 illumina 的一种试剂，来源于病毒基因组DNA。其基因序列已精确知晓，GC 比例约为 40%，与人类、哺乳类的基因组的 GC 比例接近。其基因序列又与人类的基因序列相去甚远，且不含有index。在与哺乳类基因组一起测序时，可以通过基因序列比对或数据拆分而将之去除。在测碱基不平衡的文库样本时，可以加入大量的 phix 文库，以部分抵消样本的不平衡性。也可以少量地加入phix文库，以作为 control library 来验证测序质量。
Index可以容纳多少种文库？ 以8碱基index为例，单端index文库理论上可以有4^8=65536种index，双端index文库理论上可以有65536^2=4294967296种index，但实际pooling时为了避免因对焦不准造成index读错，造成数据无法拆分，需要使用碱基分布均匀的index。
文库质检的方法： 上机前使用Aglient 2100或LabChip GX Touch生物芯片分析系统检测文库片段大小，并使用StepOnePlusTM Real-Time PCR System，以P5、P7接头作为引物进行 QPCR定量（最准确） 。由于Illumina文库开始测序之前会先以P5、P7接头为引物进行桥式PCR，在flowcell上生成簇，因此这样的上机定量结果是比较准确的。
文库pooling的原则： 1） 去除低质量的reads ：reads中质量值Q≤19的碱基占总碱基的50%以上则舍弃该条read，对于双端测序，若一端为低质量reads，则会去掉两端reads；2） 去除接头污染的reads ：reads中接头污染的碱基数大于5bp则舍弃该条read，对于双端测序，若一端受到接头污染，则去掉两端的reads；3） 去除含N较多的reads ：reads中读N碱基比例大于5%则舍弃该条read，对于双端测序，若一端含N比例大于5%，则会去掉两端reads。
Duplication 是指起始与终止位置完全一致的片段。引起Duplication的主要原因是在测序中有PCR过程，来源于同一个DNA片段PCR的产物被重复测序，就会产生duplication。次要原因是正巧两个插入片段的头和尾的位置完全一致，导致这一现象可能的原因有以下几种：a. 物种基因组小，本身的片段多样性低 ，测定的数据量多，重复的数据多；b. 建库过程中 建库起始量少，片段多样性低 ，在相同的PCR条件下，会造成文库总量低，后期数据的dup率高；c. 片段打断或加接头存在偏好性，文库的多样性较差 。Dup率计算主要有以下2种方法：一种是数据质控时计算，利用 reads 序列来计算dup，要求 read 序列一样才算作duplication，duplicate reads数目除以总 reads数目计算比率；另一种是比对分析时计算，根据read比对上基因组的位置来判断，比对的位置一样就算作duplication，一般会有 2bp的容错。
参考文献
[1] Macconaill L E, Burns R T, NagA, et al. Unique, dual-indexed sequencing adapters with UMIs effectively eliminate index cross-talk and significantly improve sensitivity of massively parallel sequencing[J]. Bmc Genomics , 2018, 19(1):30.
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测序原理:一代二代三代测序原理详解
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科普讲堂 | RNA样本提取与判读的方法及常见问题分析
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完整的单细胞分析流程——数据标化(normalization)
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