测序原理：一代二代三代测序原理详解

双脱氧链终止法采用DNA复制原理。 Sanger测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物及DNA聚合酶等。 测序反应的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。

Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa/Hiseq技术和ABI公司的SOLID技术标志第二代测序技术诞生。其中Roche公司的454测序系统是第二代测序技术中第一个商业化运营的测序平台。
其中Illumina市场规模占到75%以上，主要包括Miseq，Hiseq。下面👇就主要介绍它的PE（Pair End双端）测序原理：

名词：
flowcell： 测序反应的载体/容器，1个flowcell有8个lane
lane： 测序反应的平行泳道，试剂添加、洗脱等过程的发生位置
tile： 每次荧光扫描的位置，肉眼是看不到的
双端测序： 可能序列比较长有四五百bp，两边各测120-150bp
junction： 双端测序中间一些没有测到的区域
index(barcode)：一个lane通常要测多个样品，每个样品都加上特定的序列标签，用于区分不同样品。
flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）

打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端。
完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A，加上A之后就可以利用互补配对的原则，加上adapter，这个adpater可以分成两个部分，一个部分是测序的时候需要用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用的引物序列。
进行PCR扩增，使得我们的DNA样品浓度足够上机要求。

reads1 与 reads2 不发生重叠

flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，测序就在此进行。上面构建好的文库中的待测序列事先配置好一定的浓度，经过这里的时候，会在特异的化学试剂作用下，强力随机地附着在lane上，与上面的短序列配对。上样的结果就是lane吸附住了冲过来的DNA，并且可以在表面进行桥式PCR扩增。

双端测序之Forward Strand ：

为什么Illumina测序会有长度限制呢？

Hiseq2000测序仪
测序仪搭配了两个flowcell，简称双流动槽。比较经典的Hiseq2500一次能产出700-800Gb数据（此处Gb为测序碱基数，不同于字节数的Gb）
数据量=单端reads长度 * 单端reads个数 * 2（PE)
测序深度=数据量大小 / 参考基因组大小

这是一个新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术为标志，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，平均达到10Kb-15Kb，是二代测序技术的100倍以上，值得注意的是在测序过程中这些序列的读长也不再是相等的。

1. https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2
2. https://zhuanlan.zhihu.com/p/20702684
3. https://mp.weixin.qq.com/s/tWHWA-f1RnP_XWY66p12pg
4. https://mp.weixin.qq.com/s/9KUY43lD5miLdPZJKgRV0A

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二代测序原理
答：二代测序原理介绍如下：一、原理 二代测序原理也就是文库构建，PCR产生的片段或基因组打断的片段两端需要添加接头修饰才能进行测序。1、末端修饰。打断的片段是随机断裂，其末端可能是不平的。因此，建库第一步是补齐不平的末端。2、添加接头。经过末端修饰后的DNA片段3’末端具有突出的A尾，而接头具有...

求教三种基因测序技术的原理
答：原理：1、双脱氧链末端终止法：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。2、化学降解法：它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。技术2：单分子测序为主要特征的第三代测序技术。

一代测序原理及步骤
答：一代测序仪利用Sanger测序——双脱氧末端终止法的原理，将被荧光标记的ddNTP掺入到dNTP中，由于ddNTP随机掺入，PCR产物从引物之后的第一个碱基开始，每一个位置都有可能是ddNTP。由于ddNTP缺乏链延伸所需要的3'-OH，链的延伸就选择性地在G、A、T或C处终止。这样的PCR产物与普通PCR不一样，不能形成一...

第一代测序技术原理
答：理论上所有的位点均有可能掺入双脱氧核苷，从而产生终止于任何一个位点的寡核苷酸片段，每个片段的3’末端都是一个双脱氧的核苷酸残基，因为四种ddNTP上各有一种发光基团，在最后的识别中通过收集到的荧光信号就能够确定末端的ddNTP。上机测序：先在毛细管中注入丙烯酰胺溶液，丙烯酰胺在紫外线的电离作用下...

如何根据基因测序分析结果找通路
答：该类型测序分析结果可以广泛应用于农林鱼牧医药及海洋等各个方面的研究。图1 不同测序技术读长，准确性及基因组连续性评估 三代测序技术原理 PacBio测序原理 采用边合成边测序的方式，以其中一条DNA链为模板，通过DNA聚合酶合成另外一条链，进一步将荧光信号转变为碱基信号。同时PacBio已升级了CCS测序模式...

一代测序
答：为进一步细化基因组信息,从而加速人们探索基因的步伐,自20世纪70年代始, 测序 从理论走向现实。 链终止法(chain termination method)测序不是最早发明的测序技术,但确实为一代测序最受欢迎而广为应用的方法。该方法是1977年由Fred Sanger及其同事发明的,故常称为Sanger法。 链终止法的基本原理是利用引物促使待测片段...

全基因测序的原理和方法是什么?以测细菌基因组为例?
答：不同的测序原理不一样，分别概述如下：第一代测序，1.1 Sanger 测序　采用的是直接测序法；1.2 连锁分析　采用的是间接测序法。新一代测序 (NGS)主 要 包 括 全 基 因 组 重 测 序 (whole-genomesequencing，WGS)、全外显子组测序 (whole-exomesequencing，WES) 和目标区域测序 (Targeted r...

三代测序技术简介
答：现在的第三代测序技术中，主要以PacBio公司的SMRT和Oxford的Nanopore技术为主。与前面的两代技术比较，第三代最主要的特点在于单分子测序，就是测序的过程无需进行PCR扩增了。PacBio SMRT技术的理念在于边合成边测序，并已SMRT芯片为测序载体。原理如下：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记 4 种碱基（即...

2021-09-21三代测序技术
答：2）其实是使用的单分子测序还是扩增后测序的差异。三代测序均采用单分子测序，而二代测序均为克隆后测序 3)Ion Torrent，Illumina，PacBio采用便合成便测序，而华大的采用探针技术，nanopore采用了纳米孔测序 4）在检测方法上，Illumina，华大和PacBio采用光信号，Ion Torrent采用了pH,是第一台没有用到...

生信基础-测序原理
答：刘小泽-测序的世界 回顾测序历史，目前已经形成了三种测序方法，从上个世纪70年代的Sanger测序到90年代的二代测序，再到长度更长的三代测序，都为快速、高效获得基因序列提供了技术支持。1970s年桑格开发的能完成最长1000bp序列的双脱氧终止反应，因为该技术用于高达99.999%的测序准确率，而被用于人类基因...