qPCR检测，你需要知道这些

生物学划分为两个时代：PCR前时代和PCR后时代，这是《纽约时报》对穆利斯先生发明PCR技术的评价。1983年，Kary B. Mullis提出了PCR技术的构想， 1985年，他们在Science发表了相关的论文。论文由Mullis的同事Randall K. Saiki领衔发表，1988年Saiki等分离纯化了Taq DNA聚合酶，并将其应用于PCR反应，使PCR变得更加简单、易行和稳定，随后PCR技术迎来了蓬勃发展的时期。PCR根据其分析精度，大致经历了以下三个阶段：（I）终点PCR：定性分析（II）定量PCR：相对定量（III）数字PCR：绝对定量

早期PCR主要用于定性分析，根据反应终点产物的有或无检测靶标序列存在与否，这种PCR可以称为终点PCR，在基因鉴定、病原核酸检测等领域具有广泛应用。

1990年，Simmonds等就通过对终点产物的梯度稀释对HCV、HIV等病原体进行了粗略的拷贝数鉴定，这可能是最早的定量PCR研究。不过需要澄清一下，这里所说的定量PCR还不是指荧光定量PCR，那时还没有将荧光物质用于PCR产物的监控。直到1992年，罗氏公司的R Higuchi等在Nature发表论文，介绍了将溴化乙锭（EB）用于PCR产物动态监控的方法，这可能是最早的荧光定量PCR技术了。1996年，ABi公司公布了基于Taqman探针的qPCR技术。1997年，Wittwer等比较了（i）基于双链特异性染料SYBR Green I（ii）基于5’-核酸酶和双标探针（iii）基于Cy5的分子信标的qPCR的特点。这些研究为后来qPCR的广泛应用奠定了基础。

一般，人们习惯把qPCR分为相对定量和绝对定量，不过本质上来说，qPCR只能用于相对定量，绝对定量的实现往往需要借助“外力”。 PCR扩增是一种指数扩增，理想状态下，产物浓度与起始浓度存在如下关系：N T = N 0 ×2 n （N 0 代表起始浓度，N T 代表终点浓度，n代表循环数），对公式两边取以对数可得：log N T = logN 0 + n×log2（log代表以自然常数e为底的对数），如果我们把PCR终点的判断信号固定成一个统一的值（即qPCR中的荧光阈值），那么循环数与起始浓度的对数就成了线性关系，这就是qPCR相对定量的基本原理。不过有两个因素：（1）人的肉眼无法准确的判断PCR终点信号，于是出现了特殊的设备—荧光PCR仪；（2）不同的靶标基因的扩增效率不同，因此无法直接比较，因此催生了 ∆∆ Ct法。

真正的绝对定量PCR称为数字PCR（dPCR，1999年Kinzler等首次提出数字PCR的概念），它是在终点PCR和极限稀释的基础上通过泊松分布计算得出拷贝数的绝对定量方法。在Simmonds等的研究中，他们通过将DNA分子稀释到单拷贝，然后根据PCR的终点信号和泊松分布规律，计算了靶标基因的分子数目，不过他们没有进一步发展该技术，很长一段时间内该技术都是以分子计数的特点应用的。dPCR一方面因受到qPCR的长期压制，另一方面受到检测仪器的限制，直到2006年以后才逐渐显示出技术复苏的景象。

1993年，Zachar等在《核酸研究》上介绍了利用PCR对靶标基因进行相对定量的数学原理；2001年，Livak KJ等介绍了2 - ∆∆ Ct 法的推导过程，局限性及应用。

当然这些原理很简单，即使不看论文也很容易理解。因为PCR的指数扩增，当我们把终点的判断标准固定时，起始模板量高的样本最先到达，起始模板量低的样本消耗更多的循环数，并且每相差一个循环，代表起始浓度相差2倍，即N1/N2 = 2 -(Ct1-Ct2) 。检测不同样本时， ∆ Ct可能受样本量差异的影响，因此引入了内参基因的校正。内参基因，也叫管家基因或者看家基因，一般认为他们在生物体不同时空组织中保持恒定表达，那么两个样本内参基因的 ∆ Ct就代表了样本量的差异，靶标基因的 ∆ Ct – 内参基因的 ∆ Ct即为靶标基因的真实表达量差异，这就是2 - ∆∆ Ct 法。

但是有几个问题需要注意：（1）PCR并非全程都是指数增长期，比较必须在对数扩增期进行（2）一般默认对数增长期扩增效率是100%，这并不严谨，尤其是一些扩增困难的模板，效率可能与100%差异很大，纵向分析某基因的表达量（如基因A在不同生产阶段/不同组织的表达量）时，仍使用2 - ∆∆ Ct 可能并不太准确（3）不同靶标基因的扩增效率是不同的，因此横向比较不同靶标基因时，可能造成较大的误差。

鉴于此，我们在设计引物时，应该尽可能使靶标的长度、GC%、Tm保持接近，从而保证相近的扩增效率。 PrimerBank 和 qPrimerDB 分别是国外和国内比较优秀的qPCR引物检索网站，收录了大量物种的qPCR引物数据，具有一定参考价值。此外，Pfaffl等(2001)，Rao(2013)等对2 - ∆∆ Ct 法进行了一些校正，采用的方法主要就是通过对同一模板梯度稀释进行扩增效率校正，具有一定参考意义。

qPCR绝对定量有两种方法：（1）先获得一个拷贝数已知的参照基因，再获得靶标基因与该参照的比值，然后根据已知值获得检测样本的确切数目，从这个角度看绝对定量就是借助了“拷贝数已知”这一外力的相对定量。1990年，Gilliland等就描述了这一原理。（2）Simmonds等报道的方法，将DNA模板做极限稀释，一直到PCR体系中仅含有一个模板分子，此时只需要乘以稀释倍数就可以得到样本中靶标基因的拷贝数。这一方法是dPCR的技术原型，在实际操作中很有困难，首先需要很多稀释梯度，其次普通的10-20uL体系中仅含有一个模板分子经常很难扩增成功。

绝对定量最广泛的应用是分子计数，如RNA分子数的精确测定，DNA基因组上的基因拷贝数鉴定等。Southern杂交法是外源基因拷贝数鉴定使用最广泛的方法，但随着qPCR技术的不断发展，基于qPCR绝对定量的拷贝数鉴定的报道逐渐增多，并且大量研究表明qPCR方法与Southern杂交得到的结果基本一致甚至更加精确。Song等(2002)利用qRT-PCR估计了转基因玉米愈伤组织和植物中的转基因拷贝数，该研究还使用Southern杂交重新测量了玉米愈伤组织和植物中的“精确”转基因拷贝数，结果qRT-PCR的测量结果与“精确”结果有较高相关性，因此，他们认为 qRT-PCR可以作为一种评估转基因玉米拷贝数的有效手段。

拷贝数鉴定的关键是获得一个拷贝数已知的标准品，质粒容易提取和纯化，因此常用于构建绝对定量的标准品。把携带靶标基因的重组质粒提纯到极高的纯度，精确测定其核酸浓度，根据公式：N = 6.02 × 10 23 (copy/mol) × M DNA (g) / (DNA length(bp) × 650(g/mol/bp)) 即可计算出标准品拷贝数，式中N代表分子数目，M DNA 代表质粒重量。以此标准品绘制logN与Ct的标准曲线，然后根据靶标基因的Ct值即可反推出靶标基因的精确个数。同时我们要从基因组上选择一个基因拷贝时已知的参照基因，按同样方式绘制标准曲线、进行分子计数，然后测定统一样本中把靶标基因与参照基因的分子数，带入上述公式即可得到靶标基因的实际拷贝数。一般，应该选择基因组上拷贝数较低，物种内保守性极高的基因作为参照基因。

拷贝数鉴定具有多种形式，双标准曲线并不是必需的，如果能够确认靶标基因与参照基因的扩增效率都接近100%，也可使用2 - ∆∆ Ct 法测量靶标基因的拷贝数，林维石等(2013)就通过该方法得到了与Southern杂交一致的拷贝数鉴定结果。

基因分型的方法有很多，Landegren等(1998)在报道中综述了多种用于基因分型的技术方法，其中发展到现在应用最为广泛的就是qPCR法和测序法。测序法最为准确，并且能够发现新基因型，是基因分型或SNP检测的金标准，但它比较慢，且操作比较繁琐。qPCR检测操作简单且速度极快，目前有十分广泛的应用。

qPCR法基因分型的基本原理是：3’-末端不匹配的引物无法正常扩增靶标基因。1989年，Wu等和Newton等先后报道了ASPCR法和法用于检测等位基因，这种方法容易理解，假设已知SNP位点为A/T，如果3’-A引物PCR产物产生终点信号可判断为A基因型，3’-T引物产生终点信号为T基因型，两种引物均产生信号即为杂合型。1995年，Livak等报道了利用不同荧光标记的探针检测SNP的方法，这种方法中，分别针对两种基因型设计两条不同荧光标记的探针，并设置纯和基因型的对照，随着PCR扩增如果荧光信号靠近A参照代表A基因型，靠近B参照代表B基因型，如果位于A和B之间则为杂合型（如下图）。

2003年，Papp等报道了一种基于高分辨率溶解曲线的SNP分型方法，这种方法也是基于3’-末端不匹配的引物，A基因型设计正常长度的引物，B基因型则在引物5’端添加10-15bp的高GC序列，经过PCR扩增后，不同基因型产物的Tm就会发生变化，依赖于qPCR仪的高分辨率溶解曲线，可以快速区分基因型。

1995年以后，qPCR相关的研究论文数量呈指数式增长，成为分子生物学最热门的领域之一。近年来，随着分子诊断行业的崛起，qPCR在医疗领域发挥着越来越重要的作用。qPCR在快速发展的同时，也产生了一些问题，如判断标准不一致，检测精确度没有统一标准，RNA检测假阳性较严重等。2009年，多个科研院所及医疗单位合作发布了qPCR的 MIQE指南 ，该指南规范了qPCR的常用术语，如Ct应称为Cq，RT-PCR应写作RT-qPCR等，并对分析的敏感性、特异性、精度等进行了规范性要求，此外指南还对样本处理、核酸提取、逆转录、qPCR甚至数据分析都作了详尽的规范。该指南由9部分组成，共85个参数，以确保以qPCR实验的实用性、准确性、正确性和可重复性。虽然该指南已经有些年份，但遵守这些规范能够让你的研究更易重复，也有助于审稿人和编辑快速评估你的稿件。

注：指南的内容和附表可以在这里获取： http://rdml.org/miqe.html

参考文献
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pcr检查是什么
答：三、PCR检查的过程 PCR检查的过程包括DNA提取、设计引物、进行PCR扩增和结果分析几个步骤。首先，需要从样本中提取出目标DNA或RNA；然后，根据已知序列设计特定的引物；接着，在特定的条件下进行PCR扩增，使目标序列得到大量复制；最后，通过电泳等方法分析扩增结果，判断样本中是否存在目标序列。四、PCR检查...

什么是PCR检测?他的原理是什么?需要什么材料?
答：引物 反应缓冲液 TAQDNA聚合酶 拓展回答：反应特点 特异性强。PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合。②碱基配对原则。③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性。④靶基因的特异性与保守性。灵敏度高。PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到...

动物源性荧光PCR检测过程中需注意的问题?
答：由于分子检测荧光探针法的灵敏度非常高，故在实验操作过程中，为防止样品交叉污染及扩增产物的污染，需注意以下事项：1. 严格取样。取样需要按照取样规程来，做到专物专用（如取样袋、剪刀等），禁止一物用在多个样品上。2. 分区操作。需把样品处理、配液分装、PCR扩增，这三个过程分开，在不同的区域的...

核酸采样pcr是什么意思?
答：核酸采样为确诊病毒感染的重要手段之一。操作时，需要采集病患的鼻咽拭子或咽拭子样本，取样时要遵循严格的操作规范以便减少取样时的污染风险。取完样本后，需要将其送往专业的实验室进行PCR扩增。PCR扩增过程分为三个步骤：变性、退火和扩增，扩增过程会不断增加目标物质的浓度，使其成为检测出来的信号。扩...

荧光定量pcr(基本原理和应用领域介绍)
答：操作步骤 1.样品准备：将待检测样品中的DNA或RNA提取出来，并进行纯化和浓缩。2.试剂制备：制备PCR反应体系所需的试剂，包括PCR反应缓冲液、酶、荧光探针等。3.PCR反应：将样品中的DNA或RNA与PCR反应体系中的试剂混合，进行PCR反应。反应过程中，荧光探针与目标分子结合，发出荧光信号。4.荧光检测：利用...

pcr试验是什么意思?
答：PCR试验的广泛应用不仅为医学诊断和研究提供了有力工具，而且有助于提高我们对基础科学的了解。PCR试验通过DNA聚合酶的作用，将少量起始DNA反复扩增成了亿级的DNA分子，进而扩增目标区段DNA，并在PCR扩增过程中检测出特定DNA序列。PCR扩增反应基于核酸互补原理进行，能够在任何基因黄逸上进行扩增，仅需一个...

pcr检查是什么
答：聚合酶链式反应，简称PCR。其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可...

pcr检查是什么意思pcr检查具体是什么意思
答：需要采用这个方法进行检测。2、所以PCR并不是进行的检查，而是检测DNA的一种方法。比如乙肝病毒DNA定量，用的就是这一种方法。检查DNA的目的，一方面是可以诊断疾病，如果连病原体的DNA都能检测到，就说明感染了这种病原体；另一方面是判断病毒复制的多少，从而判断病情严重程度或者治疗效果。

核酸检测是什么意思怎么检测(了解核酸检测的原理和方法)
答：适用于检测RNA病毒，如新型冠状病毒。3.LAMP：LAMP是一种新型的核酸扩增方法，不需要PCR仪，通过多个酶的协同作用，可以在恒温条件下扩增目标序列。此外，还有一些新兴的核酸检测方法，如CRISPR-Cas技术、纳米孔测序等，它们在检测速度、准确性和便携性等方面有所突破。

如何用PCR方法检测基因的多样性
答：致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变,用限制酶切割基因组时,���钠�问�亢兔扛銎�蔚某ざ染筒煌��此�降南拗菩云�纬ざ榷嗵�裕�贾孪拗破�纬ざ确⑸�谋涞拿盖形坏悖�殖莆�嗵�晕坏恪W钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测,后来采用聚合酶链反应(PCR)与限制酶...