液相色谱原理 液相色谱仪的原理是什么？用来干什么？
特点
1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。
高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：
1 ．液 — 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)
流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：
式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。
a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。
b. 反相液 — 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。
c. 液 — 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。
2 ．液 — 固色谱法
流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：
Xm + nSa ====== Xa + nSm
式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。
当吸附竞争反应达平衡时：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]
3 ．离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)
IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。
以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：
X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)
当交换达平衡时：
KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]
分配系数为：
DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]
[讨论：DX与保留值的关系]
凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。
4 ．离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)
离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：
X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相
式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的离子对化合物。
当达平衡时：
KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相
根据定义，分配系数为：
DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相
[讨论：DX与保留值的关系]
离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。
5 ．离子色谱法(Ion Chromatography)
用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。
以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：
抑制柱上发生的反应：
R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O
R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-
可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-，可用电导法灵敏的检测。
离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。
6 ．空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)
空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。
高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、．分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。
1．进样系统
一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。
2．输液系统
该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l．47～4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。
3.分离系统
该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。
另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。
再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。
4．检测系统
高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。
（1）紫外检测器
该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。
（2）示差折光检测器
凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。
（3）荧光检测器
凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。
（5）数据处理系统
该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
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它利用物质在两相中吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的，当物质在两相中做相对反复的运动，使原来微小的差异产生了很大效果，来达到分离分析的
层析分配分离
高效液相色谱法的原理是什么？~
液相色谱仪系统是由由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。
液相色谱仪的原理：储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据就可以以图谱形式打印出来，以便研究人员分析。
液相色谱仪的用途：
在聚合物的分析中，吸附色谱一般用来分离添加剂，如偶氮染料、抗氧化剂、表面活性剂等，也可用于石油烃类的组成分析。
用于氨基酸、蛋白质的分析，也适合于某些无机离子(NO3-、SO42-、Cl-等无机阴离子和Na+、Ca2+、Mg2+、K+等无机阳离子)的分离和分析，具有十分重要的作用。
适用于水溶液的体系，又适用于有机溶剂的体系。当所用的洗脱剂为水溶液时，称为凝胶过滤色谱，其在生物界的应用比较多。
拓展回答：
液相色谱仪的应用：高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。与试样预处理技术相配合，HPLC所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂相体中的微量成分。
随着固定相的发展，有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离HPLC成为解决生化分析问题最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。
参考资料：百度百科 液相色谱仪
高效液相反相色谱具有什么原理?
答：在反相键合相色谱法中使用的是非极性键合固定相。它是将全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活化处理后与含轻基链(c4、C8、C18)或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基或苯基的非极性固定相。如共价结合到载体上的直链碳氢化合物正辛基等。关于反相色谱的分离机理,吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上...
色谱分析原理
答：色谱分析原理如下：一、基本原理：色谱分析有两个要素——流动相和固定相。在流动相从固定相的一端流到另一端的过程中，加在固定相起始端的溶质随流动相流动，并在流动相和固定相之间来回转移。不同的溶质与这两相的亲和力大小不同，溶质的移动速度也不同，因而得到分离。固定相一般是固体，也可以是...
气相色谱分析的基本原理是什么?
答：气相色谱分析的基本原理是：利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体带入色谱柱，柱内含有液体或固体固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。气相色谱分离过程中，溶质分子与...
简要说明气相色谱分析的基本原理。
答：气相色谱分析的基本原理：气相色谱分析是使混合物中各组分在两相间进行分配，其中一相是不动的（固定相）,另一相（流动相）携带混合物流过此固定相，与固定相发生作用，在同一推动力下，不同组分在固定相中滞留的时间不同，依次从固定相中流出，又称色层法或者层析法。，组分在固定相与流动相之间不断...
反相高效液相色谱法原理
答：一、基本原理：1.疏水性固定相：反相色谱柱通常使用疏水性的固定相材料，如疏水链状碳氢化合物改性的硅胶或封闭的C18链，使分析物在移动相中具有亲水性，与固定相表面发生疏水作用。2.亲水性移动相：移动相一般由水和有机溶剂混合而成，亲水性较强。通过调节有机溶剂的类型和浓度，可以控制移动相的极性...
GC气相色谱仪原理及应用是什么?
答：1、气相色谱原理：GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于...
[毛细管气相色谱] 毛细管气相色谱法原理
答：◇ 色谱动力学认为:填充柱可看作是一束长毛细管的组合,其内径约等于粒子粒度,因其弯曲,多径扩散严重,故理论板数少。 毛细管柱完全没有这些缺陷,故理论板数可高大106数量级。 ◆ 用毛细管柱,有利于: ⊙ 提高色谱分离能力, ⊙ 加快色谱分析速度, ⊙ 促进色谱的应用都是十分必要的: 二、毛细管色谱法的相关理论 ...
液相色谱工作原理
答：储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度...
高效液相色谱法的原理
答：原理：流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于高效液相色谱计算公式：式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm—溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积...
HPLC原理及基本操作是什么?
答：与食品工业的研究上。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，可将液体混合物中的成分分离、成分定性及定量分析。适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。例如：可检测分析食品中的三聚氰胺的含量。
