RNA的提取方法步骤及原理. 用trizol法提取RNA的方法及每一步的原理.

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。

水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

扩展资料

与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。

RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。

在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。

参考资料来源：百度百科-RNA

总RNA的抽提方法:

目前常用的方法是用异硫氰酸胍苯酚抽提法。

Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。

提取步骤:

先用液氮研磨材料，匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，获得比较纯的总RNA,用于下一步mRNA的纯化。也可将含有RNA样品的细胞破碎液通过硅胶膜纯化柱纯化。

RNA浓度和纯度判断:

OD260为1时相当于浓度为50 ug/mL;

OD260/0D280值在1.8~ 2.0之间，表示纯度较好;

0D260/OD280值低于1.8，样品有蛋白质或酚污染;

0D260/0D280值大于2.0，提取的RNA可能有降解;

电泳后如果rRNA大小完整，而且28S rRNA和18SrRNA亮度接近2:1、mRNA分布均匀，则认为RNA。

原理没找到，以下是方法和步骤。
总RNA（total RNA）和信使RNA(mRNA)的抽提
1、实验目的
提取人体细胞的总RNA和mRNA。

2、本实验所需试剂
1）、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件，
2）、PBS缓冲液， TRIZOL试剂，
3）、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,
4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇，
5）、mRNA分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。
6）、新配的电泳缓冲液，专跑RNA的琼脂糖（Agarose）。

3、实验流程(掌握内容)
3.1 细胞总RNA的提取
1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司） 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。
2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15秒。
3）、室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。
4）、12000 rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃离心。
5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟， DEPC处理水20-30 ul加入，中枪打匀，55-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。
6）、电泳。

3.2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）
1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 ul。
2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打匀或用手弹匀。
3）、70℃水浴，3分钟（裂解RNA的二级结构）。
4）、20-30℃条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）。
5）、高速离心2分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 ul的上清在原管里。
6）、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。
7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液。
8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 ul热的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。
9）、为保证最大的 mRNA产量，可再次重复第8步。
10）、电泳。

4、mRNA的应用(了解内容)：
RT-PCR, Northern杂交，cDNA文库构建, mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应(Primer Extension)，体外转录(In Vitro RNA Transcription), RNA标记(RNA labeling)，RNA酶保护试验(RNase and S1 Nuclease Protection Assay)，RNA微注射(RNA Microinjection)

动植物组织mRNA提取实验方法

作者：admin 来源：本站原创 2006-1-16

一、材料
水稻叶片或小鼠肝组织。
二、设备
研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂
1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。
4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。
四、操作步骤
（一）动植物总RNA提取-Trizol法
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

（二）mRNA提取
由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。
1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。
4、将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。
7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20℃30分钟。
8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。
9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。
10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

你可以看看《分子克隆》书上都有的。

分子克隆技术（华农）

实验一 质粒的制备

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。

质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。

实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。

实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。

实验原理：在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

实验步骤：

1. 取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养；

2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜培养；

3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；

4. 加入300 ml溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； （剧烈）

5. 加入300 ml溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；

6. 加入300 ml溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；（温和）

7. 12000 g离心10分钟；

8. 吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；

9. 12000 g 常温离心15分钟；

10. 倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；

11. 室温放置或超净台上风干DNA；

12. 加40 ml灭菌超纯水或TE溶解；

13. 质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。

附注：质粒检测

电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型

吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。

实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。

实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。

实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA

去买生物公司的rna提取试剂盒,这样比自己配试剂提取出来的要纯净的多,量也多,还方便.买了不同量的提取试剂盒后,上面会有操作步骤

RNA的提取方法~

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb
2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。
3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。
4、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）
5、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
6、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。
7、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。

扩展资料：
DNA提取原则：
1、保证核酸一级结构的完整性；
2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；
3、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；
4、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
参考资料来源：百度百科——DNA提取

实验步骤：
1. 提取组织RNA时，每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解：提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5~106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；
2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在试问15~30℃下放置5分钟；
3. 在上述EP管中，按照每1mlTrizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15~30℃）放置2~3分钟后，12000g（2~8℃）离心15分钟；
4. 去上层水相置于新EP管中，按照每1mlTrizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15~30℃）放置10分钟后，12000g（2~8℃）离心10分钟；
5. 弃上清，按照每1ml Trizol加1ml75% 乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2~8℃）离心5分钟，弃上清；
6. 让沉淀的RNA在室温在自然干燥；
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀


各试剂的作用：
1、 TRIZOL
主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。
TRIZOL是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIZOL能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。
※0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。
※异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。

2、 氯仿
为有机溶剂与水互不相溶，RNA（核糖核“酸”的盐型）是离子化合物，溶于水相

3、异丙醇
能与与任意比例的水混合，因此加入异丙醇，能够夺取RNA/DNA周围的水分，RNA/DNA能够聚集而发生沉淀。

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